Mittels Durchflusszytometrie mit Anti-HLA-Antikörpern könnten die diagnostischen Möglichkeiten in der Stammzell-Transplantation erweitert und die therapeutische Intervention präzisiert werden. Die schnell verfügbaren Ergebnisse machen eine frühe und daher möglichst wenig eingreifende Intervention möglich.

Die HLA-nichtidentische Stammzell-Transplantation (SZT) ist heute eine realistische Option, allerdings ist hier das Risiko einer Abstoßung durch HLA-Unterschiede größer. Für die frühe Diagnose und Behandlung ist eine minutiöse Analyse des T-Zell-Chimärismus daher essenziell. Die Unterschiede bei HLA-Antigenen bieten jedoch den Vorteil, Spender- und Empfängerzellen zu unterscheiden. Denn anders als Minor-Antigene können Major-Histokompatibilität-Antigene von monoklonalen Antikörpern (AK) erkannt werden. Hierbei ermöglicht die Durchflusszytometrie eine sehr präzise und empfindliche Identifikation von Spender- und Empfängerzellen. Besondere Konditionierungsregime und umfassende T-Zelldepletion beschleunigen ein Engraftment mit geringerer Ausprägung der Graft-versus-Host Disease (GvHD).

Antikörper - Durchflusszytometrie -Chimärismus-Analyse

Unter Verwendung von HLA-spezifischen AK kombiniert mit Lineage-spezifischen AK wurde peripheres Blut (PB) von 23 Patienten mit Transplantaten von HLA-nichtidentischen verwandten Spendern auf autologe Zellen beobachtet (Tab. 1). FITC-markierte und biotinylierte AK (one-lambda, CA, USA) waren für folgende HLA-Serotypen verfügbar: A2/28, A3, A9, B7/27, B8, B12, B27 und Bw4 oder Bw6 konnten auch zum Nachweis von Split-Antigenen verwendet werden. Die Differentialexpression von HLA-Molekülen auf Spender und Empfänger wurde vor der Transplantation bestätigt.

Markierung und Analyse nach Standardverfahren: 100 µl Vollblut wurden 20 Minuten mit je 20 µl monoklonalen AK inkubiert, sechs Minuten mit 4 ml Lysepuffer FACSLyse (Becton Dickinson Immunocytometry System, BDIS, San Jose, USA) lysiert, bei 400 g für sieben Minuten zentrifugiert und mit 4 ml Puffer (FACSFlow, BDIS) gewaschen. Dann wurden die Zellen auf einem FACSCalibur Durchflusszytometer (BDIS) und mit Cellquest Software analysiert. Filter wurden auf Lymphozyten und weitere relevante Zellen, wie CD5+, CD3+ und CD56+, eingestellt.

Die Prozentanteile markierter und nichtmarkierter Zellen wurden im Anschluss bestimmt.

Der Nachweis von Chimärismus wurde durch PCR (Polymerase Chain Reaction) auf immunomagnetisch isolierten T-Zellen ermittelt. Periphere Blutzellen wurden mit CD3-gelabelten Beads (Dynal, Oslo, NOR) für 30 Min. inkubiert, dann einem Magnetfeld ausgesetzt und ungebundene Zellen ausgewaschen. Positiv selektierte Zellen wurden mit PCR analysiert.

Fluoreszenz-Intensität von Leukozyten-Subpopulationen

Granulozyten hatten eine ca. 1 Log niedrigere Fluoreszenz-Intensität als Monozyten und Lymphozyten. Deshalb wurden nur sich entsprechende Subpopulationen mit ihrer Fluoreszenz-Intensität verglichen. Tabelle 1 demonstriert: Der Patient wies den Phänotyp A2/24 B44/40 auf, der zur Kategorie Bw4/6 zählt. A24 kann durch A9 als Split-Antigen erfasst werden, sowie B44 durch B12. B40 (Bw6-Familie) kann durch Bw6-AK erkannt werden. Der Patient erhielt Stammzellen des für A9 negativen Vaters. Also wurden HLA-A9 und BW6 zur Identifizierung der Spenderzellen verwendet. Bei mütterlichem Spender wäre B12 passend gewesen.

T-Zell-Chimärismus nach haploidenter Transplantation

24 Patienten wurden nach der Transplantation auf T-Zell-Erholung und T-Zell-Chimärismus im PB untersucht. Die Fluoreszenz-Intensität von HLA-AK gegen dasselbe HLA-Antigen variierte von Patient zu Patient. Folglich untersuchten wir Prätransplantat-Proben sowohl von Spender als auch Empfänger auf Baseline-Fluoreszenz-Levels, und damit verglichen wir die Fluoreszenz-Intensität von Post-Transplantat-Proben (Tab. 1). Außer in einem Fall konnten Spender- und Empfängerzellen unterschieden werden mittels HLA-Differenzen und AK. Für einen Patienten wurde mangels FITC-markiertem AK Biotin-markierter A3-AK verwendet. Bei einem Patienten war die Ausprägung der Fluoreszenz-Intensität zwischen Spender- und Empfänger-Zellen für eine Analyse zu niedrig. Ein gemischter Chimärismus wurde bei 15 Patienten mehrfach im PCR-Verfahren bestätigt. Durch immunologische Intervention wurde bei 14 Patienten vollständiger Chimärismus erreicht. Eine Abstoßungsreaktion wurde bei drei Patienten beobachtet, bei zwei Patienten hatte eine zweite Transplantation Erfolg.

Mixed-Lineage-Chimärismus

Mixed-Lineage-Chimärismus wurde drei Jahre nach haploidenter Transplantation, die ohne Konditionierung (mütterliche haploidente Spenderin) bei einer Patientin mit SCID (severe combined immunodeficiency) erfolgt war, beobachtet. Daher konnten theoretisch alle Lineages außer T-Zellen sowohl von der Spenderin als auch von der Empfängerin stammen. Obwohl alle T- und NK-Zellen dem Spendertyp (B12+) entsprachen, waren die B-Zellen noch weitgehend vom Empfängertyp (B12-). Granulozyten und Monozyten bestanden vorwiegend aus Empfängerzellen.